1. Изучение меж- и внутривидового интеграционного полиморфизма ретроэлементов
2. Изучение влияния ретроэлементов на функционирование генов человека
3. Разработка классификации LTR HERV-K
4. Создание базы данных полиморфных ретроэлементов
5. Поиск молекулярных основ аутоимунных заболеваний


Изучение меж- и внутривидового интеграционного полиморфизма ретроэлементов
В нашей лаборатории впервые была разработана стратегия экспериментального сравнительного анализа распределения интеграций ретроэлементов в геномах близкородственных видов, основанная на применении методов вычитающей гибридизации геномных ДНК и скрининга геномных клонотек (Mamedov et al. 2002; Buzdin et al. 2002). В результате впервые выполненного полногеномного сравнительного анализа нами был выявлен и охарактеризован ряд существенных молекулярно-генетических отличий генома человека от генома шимпанзе: открыта и картирована представительная группа ретроэлементов, специфичных для генома человека; проанализированы генное окружение и структурно-функциональные особенности 120 LTR и свыше 80 L1 видоспецифических элементов; составлен каталог генов человека, содержащих интеграции эволюционно молодых LTR HERV-K элементов (Buzdin et al. 2003; Buzdin et al. 2003; Mamedov et al. 2004; Mamedov et al. 2004; обобщено в Lebedev in "Retroviruses and primate genome evolution" 2005).
Также в нашей лаборатории был создан новый экспериментальный метод, позволяющий осуществлять полногеномную идентификацию инсерционно-делеционного полиморфизма среди представителей одного вида. Метод позволяет проводить эффективную идентификацию полиморфизмов вне зависимости от доступности и полноты нуклеотидных последовательностей исследуемого генома. Метод был успешно использован для идентификации 41 новых полиморфных человек специфических AluYa5/Ya8 инсерций. 18 из них были впервые обнаружены в данной работе и ранее отсутствовали в международных базах данных, что подтверждает преимущества разработанного экспериментальных подхода (Mamedov et al. 2005). Вновь идентифицированные полиморфные инсерции AluY и L1-Ta элементов генома человека использованы для разработки наборов молекулярно-генетических маркеров, включающих, к настоящему времени, свыше 110 пар локус-специфических ПЦР-праймеров. Эффективность и информативность созданных наборов продемонстрирована при генотипировании и генетическом мониторинге клеточных линий (Ustygova et al. 2005), а также при популяционно-генетическом анализе различных этнических групп населения России (Mamedov et al. 2004; Kutuev et al. 2006; Хусаинова и др. 2004).

Изучение влияния ретроэлементов на функционирование генов человека
С целью изучения механизмов влияния ретроэлементов на функционирование генов человека предложен новый метод попарного сравнения транскрипционной активности аллелей генов, отличающихся по наличию инсерций AluY и L1-Ta элементов в регуляторных и интронных областях (Устюгова и др. 2006). По результатам анализа 47 генов в 12 клеточных линиях человека, гетерозиготных по интронным инсерциям AluY и L1-Ta элементов открыт ингибирорный эффект ряда исследуемых ретроэлементов. Показана выраженная тканеспецифичность проявления обнаруженного эффекта, независимость эффекта от структурных особенностей индивидуальных AluY элементов и корреляция эффекта с наличием протяженных 5'- концевых фрагментов в составе инсерций L1-Ta элементов (Ustyugova et al. 2006; Lebedev et al. 2006).
Также нами был проведен анализ функциональных свойств широкого набора индивидуальных LTR элементов, отличающихся по расположению в геноме человека и генному окружению, принадлежности к систематической группе и эволюционному возрасту. С использованием метода торможения в геле (MSA) выявлен и охарактеризован регуляторный участок в энхансерной области HERV-K LTR элементов, специфически связывающийся с комплексом из трех ядерных белков ERF1, 2, 3 (Akopov et al. 1998). С использованием систем транзиентной экспрессии репортерного гена люциферазы в различных клеточных линиях человека проведен анализ промотерной и энхансерной активности полноразмерных HERV-K LTR элементов и их фрагментов. Показано наличие альтернативного противоположно направленного промотера и тканеспецифического энхансера в составе структуры LTR. Открыт и охарактеризован негативный регуляторный элемент, расположенный в U5 функциональной области HERV-K LTR. Доказано сохранение отдельными LTR элементами генома человека своего регуляторного потенциала и функциональных свойств на протяжении десятков миллионов лет эволюции приматов (Domansky et al. 2000; Доманский и др. 2002). В рамках изучения влияния интеграций ретроэлементов на экспрессию генов человека нами был разработан оригинальный метод определения статуса метилирования участков генома, содержащих длинные концевые повторы эндогенных ретровирусов (LTR HERV-K). Определен статус и профиль метилирования 50-ти LTR, специфичных для генома человека, в ДНК из двух тканей - мозжечка и лимфоузла - и наборе клеточных линий различного тканевого происхождения. Показано, что метилирование LTR элементов, в том числе находящихся в интронах и регуляторных областях генов, имеет выраженный тканеспецифический характер, а индивидуальные LTR могут быть использованы как информативные маркеры метилирования различных локусов генома человека (Ходосевич и др. 2004; Khodosevich et al. 2004).

Разработка классификации LTR HERV-K
Впервые выполнен исчерпывающий структурно-эволюционный анализ LTR элементов семейства HERV-K - наиболее представленной в геноме и функционально-активной группы эндогенных ретровирусов. По результатам структурного анализа 150 вновь идентифицированных и секвенированных LTR впервые разработана систематика HERV-K элементов генома. Выявлено существование двух подсемейств, состоящих из 16 отдельных групп LTR HERV-K. Для каждой из групп определены характеристические участки первичной структуры и урони внутригрупповой дивергенции; обоснована гипотеза существования нескольких мастер-генов LTR HERV-K и рассчитан эволюционный возраст каждой из групп LTR элементов (Хиль и др. 1997; Lavrentieva et al. 1998). С целью экспериментальной проверки сделанных теоретических постулатов на основе первичной структуры участков интеграции LTR элементов генома человека сконструированы наборы ПЦР-адаптированных филогенетических маркеров и проведен широкомасштабный сравнительный анализ LTR-содержащих локусов генома человека и ортологичных локусов геномов современных видов приматов (Lapuk et al. 1999; Lebedev et al. 2000; Nadezhdin et al. 2001). На основании полученных результатов сделан вывод о нескольких волнах распространения HERV-K элементов по геному, возникавших в результате последовательной серии транспозиционных взрывов (Lebedev et al. 2000) . По результатам выполненного биоинформационного и экспериментального анализа возраста индивидуальных LTR элементов и их систематических групп определена эволюционная динамика распространения эндогенных ретровирусов HERV-K в геноме. Показано существование в эволюции генома приматов нескольких продолжительных волн ретротранспозиций HERV-K элементов, совпадающих по времени с периодами дивергенции основных таксономических групп и видов приматов, включая период эволюционного расхождения линий высших приматов и человека. Cформулирована концепция, согласно которой перемещения мобильных элементов генома, включая LTR элементы эндогенных ретровирусов человека, вызывают эволюционно значимые изменения систем регуляции экспрессии генов и являются важной молекулярно-генетической причиной видообразования у приматов (Лебедев 2000 \обзор\; Lebedev 2000; Khodosevich et al. 2002).

Создание базы данных полиморфных ретроэлементов
Данные, полученные в нашей лаборатории в ходе поиска новых полиморфных интеграций ретроэлементов (Mamedov et al. 2005; Mamedov et al. 2004; Buzdin et al. 2003; Buzdin et al. 2002) и уже известные полиморфизмы были суммированы в созданной нами электронной базе данных PRED (от английского Polymorphic RetroElements Database). База данных спроектирована с учетом возможных запросов широкого круга исследователей в области популяционной и медицинской генетики, а также сравнительной геномики человека. В современном информационном пространстве существует большое количество баз данных, систематизирующих существующую информацию о полиморфизмах в геноме человека. Подавляющее большинство таких ресурсов посвящено мононуклеотидному полиморфизму, однако встречаются и ресурсы, описывающие короткие прямые повторы или различные другие молекулярно-генетические маркеры. Такие базы данных, как правило, не дают возможности конструировать молекулярно-генетические маркеры (МГМ), так как содержащейся в них информации недостаточно и требуется обращение к нескольким информационным ресурсам. Созданный нами интернет ресурс представляет собой первый пример базы данных, позволяющей легко и быстро конструировать МГМ с заданными параметрами на основе инсерционного полиморфизма ретроэлементов. Такая возможность обеспечивается не только наличием необходимого набора данных в базе, но и возможностью поиска по большому количеству параметров, а также наличием перекрестных ссылок на другие базы данных, позволяющие дополнить результаты поиска.

Поиск молекулярных основ аутоимунных заболеваний
Основной целью этого направления исследований нашей лаборатории является разработка новых экспериментальных подходов к селективной супрессии патологических клонов Т-лимфоцитов, с экспансией которых предположительно связано развитие ряда аутоиммунных и отдельных типов онкологических заболеваний.
В качестве объекта исследования нами был выбран репертуар периферических Т-лимфоцитов из образцов крови пациентов с анкилозирующим спондилитом (Болезнь Бехтерева) на разных стадиях заболевания. К настоящему моменту, методом массированного прямого секвенирования ранжированных клонотек специфических фрагментов кДНК TCR из трех индивидуальных больных анкилозирующим спондилитом нами были идентифицированы выраженные клональные экспансии ряда клонов Т-лимфоцитов. Подобных экспансий в норме не наблюдается для здоровых людей, что подтверждается и нашими экспериментальными данными. Более того, мы продемонстрировали, что ряд таких клональных экспансий в крови больных анкилозирующим спондилитом держится на стабильно высоком уровне представленности в течение не менее 2-х лет. По мере накопления данных по характеристике клональных экспансий Т-лимфоцитов из ряда пациентов мы рассчитываем выявить закономерности как в типе Т-лимфоцитов, так и в структуре представляемых ими TCR. Уже сегодня полученные данные позволяют сделать предварительные выводы о неслучайном распределении клональных экспансий Т-лимфоцитов в крови больных анкилозирующим спондилитом.
Вторая часть проекта направлена на разработку эффективных и безопасных методов селективной супрессии семейств и клонов Т-лимфоцитов с использованием различных вариантов TCR-вакцинации. На модели линии мышей BALB мы планируем провести сравнительное тестирование ряда существующих подходов (таких как иммунизация пептидами, соответствующими CDR2 и CDR3 мотивам TCR, иммунизация V доменами TCR и ДНК-иммунизация соответствующими фрагментами), их модификаций и некоторых принципиально новых вариантов вакцинации. По целому ряду из указанных подходов уже ведется активная работа. В конечном итоге, целью данного направления проекта является отработка метода иммунизации, направленного на провокацию выраженного и специфичного иммунного ответа и эффективное подавление выбранных семейств либо клонов Т-лимфоцитов, при минимальных побочных эффектах и минимальном влиянии на представленность других семейств и клонов в репертуаре периферических Т-лимфоцитов.