1.
Изучение меж- и внутривидового интеграционного полиморфизма
ретроэлементов
2. Изучение влияния
ретроэлементов на функционирование генов человека
3. Разработка
классификации LTR HERV-K
4. Создание базы
данных полиморфных ретроэлементов
5. Поиск молекулярных
основ аутоимунных заболеваний
Изучение меж- и внутривидового
интеграционного полиморфизма ретроэлементов
В нашей лаборатории впервые была разработана стратегия
экспериментального сравнительного анализа распределения интеграций
ретроэлементов в геномах близкородственных видов, основанная на
применении методов вычитающей гибридизации геномных ДНК и скрининга
геномных клонотек (Mamedov et al. 2002;
Buzdin
et al. 2002).
В результате впервые выполненного полногеномного сравнительного анализа
нами был выявлен и охарактеризован ряд существенных
молекулярно-генетических отличий генома человека от генома шимпанзе:
открыта и картирована представительная группа ретроэлементов,
специфичных для генома человека; проанализированы генное окружение и
структурно-функциональные особенности 120 LTR и свыше 80 L1
видоспецифических элементов; составлен каталог генов человека,
содержащих интеграции эволюционно молодых LTR HERV-K элементов (Buzdin et al. 2003;
Buzdin et al. 2003;
Mamedov et al. 2004;
Mamedov et al. 2004;
обобщено в Lebedev in "Retroviruses and
primate genome evolution" 2005).
Также в нашей лаборатории был создан новый экспериментальный метод,
позволяющий осуществлять полногеномную идентификацию
инсерционно-делеционного полиморфизма среди представителей одного вида.
Метод позволяет проводить эффективную идентификацию полиморфизмов вне
зависимости от доступности и полноты нуклеотидных последовательностей
исследуемого генома. Метод был успешно использован для идентификации 41
новых полиморфных человек специфических AluYa5/Ya8 инсерций. 18 из них
были впервые обнаружены в данной работе и ранее отсутствовали в
международных базах данных, что подтверждает преимущества
разработанного экспериментальных подхода (Mamedov et al.
2005). Вновь идентифицированные полиморфные инсерции AluY и L1-Ta
элементов генома человека использованы для разработки наборов
молекулярно-генетических маркеров, включающих, к настоящему времени,
свыше 110 пар локус-специфических ПЦР-праймеров. Эффективность и
информативность созданных наборов продемонстрирована при
генотипировании и генетическом мониторинге клеточных линий
(Ustygova et al. 2005), а также при популяционно-генетическом
анализе различных этнических групп населения России
(Mamedov et al. 2004; Kutuev et al. 2006;
Хусаинова и др.
2004).
Изучение влияния ретроэлементов на
функционирование генов человека
С целью изучения механизмов влияния ретроэлементов на функционирование
генов человека предложен новый метод попарного сравнения
транскрипционной активности аллелей генов, отличающихся по наличию
инсерций AluY и L1-Ta элементов в регуляторных и интронных областях (Устюгова и др.
2006). По результатам анализа 47 генов в 12 клеточных линиях
человека, гетерозиготных по интронным инсерциям AluY и L1-Ta элементов
открыт ингибирорный эффект ряда исследуемых ретроэлементов. Показана
выраженная тканеспецифичность проявления обнаруженного эффекта,
независимость эффекта от структурных особенностей индивидуальных AluY
элементов и корреляция эффекта с наличием протяженных 5'- концевых
фрагментов в составе инсерций L1-Ta элементов
(Ustyugova et al. 2006; Lebedev et al. 2006).
Также нами был
проведен анализ функциональных свойств широкого набора индивидуальных
LTR элементов, отличающихся по расположению в геноме человека и генному
окружению, принадлежности к систематической группе и эволюционному
возрасту. С использованием метода торможения в геле (MSA) выявлен и
охарактеризован регуляторный участок в энхансерной области HERV-K LTR
элементов, специфически связывающийся с комплексом из трех ядерных
белков ERF1, 2, 3 (Akopov et al. 1998).
С использованием систем транзиентной экспрессии репортерного гена
люциферазы в различных клеточных линиях человека проведен анализ
промотерной и энхансерной активности полноразмерных HERV-K LTR
элементов и их фрагментов. Показано наличие альтернативного
противоположно направленного промотера и тканеспецифического энхансера
в составе структуры LTR. Открыт и охарактеризован негативный
регуляторный элемент, расположенный в U5 функциональной области HERV-K
LTR. Доказано сохранение отдельными LTR элементами генома человека
своего регуляторного потенциала и функциональных свойств на протяжении
десятков миллионов лет эволюции приматов (Domansky et al.
2000; Доманский и др. 2002).
В рамках изучения влияния интеграций ретроэлементов на экспрессию генов
человека нами был разработан оригинальный метод определения статуса
метилирования участков генома, содержащих длинные концевые повторы
эндогенных ретровирусов (LTR HERV-K). Определен статус и профиль
метилирования 50-ти LTR, специфичных для генома человека, в ДНК из двух
тканей - мозжечка и лимфоузла - и наборе клеточных линий различного
тканевого происхождения. Показано, что метилирование LTR элементов, в
том числе находящихся в интронах и регуляторных областях генов, имеет
выраженный тканеспецифический характер, а индивидуальные LTR могут быть
использованы как информативные маркеры метилирования различных локусов
генома человека (Ходосевич и др.
2004; Khodosevich et al.
2004).
Разработка классификации LTR HERV-K
Впервые выполнен исчерпывающий структурно-эволюционный анализ LTR
элементов семейства HERV-K - наиболее представленной в геноме и
функционально-активной группы эндогенных ретровирусов.
По результатам структурного анализа 150 вновь идентифицированных и
секвенированных LTR впервые разработана систематика HERV-K элементов
генома. Выявлено существование двух подсемейств, состоящих из 16
отдельных групп LTR HERV-K. Для каждой из групп определены
характеристические участки первичной структуры и урони внутригрупповой
дивергенции; обоснована гипотеза существования нескольких мастер-генов
LTR HERV-K и рассчитан эволюционный возраст каждой из групп LTR
элементов
(Хиль и др. 1997; Lavrentieva et al.
1998). С целью экспериментальной проверки сделанных теоретических
постулатов на основе первичной структуры участков интеграции LTR
элементов генома человека сконструированы наборы ПЦР-адаптированных
филогенетических маркеров и проведен широкомасштабный сравнительный
анализ LTR-содержащих локусов генома человека и ортологичных локусов
геномов современных видов приматов (Lapuk et al. 1999;
Lebedev et al. 2000;
Nadezhdin et al.
2001). На основании полученных результатов сделан вывод о
нескольких волнах распространения HERV-K элементов по геному,
возникавших в результате последовательной серии транспозиционных
взрывов (Lebedev et al.
2000) .
По результатам выполненного биоинформационного и экспериментального
анализа возраста индивидуальных LTR элементов и их систематических
групп определена эволюционная динамика распространения эндогенных
ретровирусов HERV-K в геноме. Показано существование в эволюции генома
приматов нескольких продолжительных волн ретротранспозиций HERV-K
элементов, совпадающих по времени с периодами дивергенции основных
таксономических групп и видов приматов, включая период эволюционного
расхождения линий высших приматов и человека. Cформулирована концепция,
согласно которой перемещения мобильных элементов генома, включая LTR
элементы эндогенных ретровирусов человека, вызывают эволюционно
значимые изменения систем регуляции экспрессии генов и являются важной
молекулярно-генетической причиной видообразования у приматов (Лебедев 2000
\обзор\; Lebedev 2000;
Khodosevich et al. 2002).
Создание базы данных полиморфных
ретроэлементов
Данные, полученные в нашей лаборатории в ходе поиска новых полиморфных
интеграций ретроэлементов (Mamedov et al. 2005; Mamedov et al. 2004; Buzdin et al. 2003;
Buzdin et al. 2002)
и уже известные полиморфизмы были суммированы в созданной нами
электронной базе данных PRED (от
английского Polymorphic RetroElements Database). База данных
спроектирована с учетом возможных запросов широкого круга
исследователей в области популяционной и медицинской генетики, а также
сравнительной геномики человека. В современном информационном
пространстве существует большое количество баз данных,
систематизирующих существующую информацию о полиморфизмах в геноме
человека. Подавляющее большинство таких ресурсов посвящено
мононуклеотидному полиморфизму, однако встречаются и ресурсы,
описывающие короткие прямые повторы или различные другие
молекулярно-генетические маркеры. Такие базы данных, как правило, не
дают возможности конструировать молекулярно-генетические маркеры (МГМ),
так как содержащейся в них информации недостаточно и требуется
обращение к нескольким информационным ресурсам. Созданный нами интернет
ресурс представляет собой первый пример базы данных, позволяющей легко
и быстро конструировать МГМ с заданными параметрами на основе
инсерционного полиморфизма ретроэлементов. Такая возможность
обеспечивается не только наличием необходимого набора данных в базе, но
и возможностью поиска по большому количеству параметров, а также
наличием перекрестных ссылок на другие базы данных, позволяющие
дополнить результаты поиска.
Поиск молекулярных основ аутоимунных
заболеваний
Основной целью этого направления исследований нашей лаборатории
является разработка новых экспериментальных подходов к селективной
супрессии патологических клонов Т-лимфоцитов, с экспансией которых
предположительно связано развитие ряда аутоиммунных и отдельных типов
онкологических заболеваний.
В качестве объекта исследования нами был выбран репертуар
периферических Т-лимфоцитов из образцов крови пациентов с
анкилозирующим спондилитом (Болезнь Бехтерева) на разных стадиях
заболевания. К настоящему моменту, методом массированного прямого
секвенирования ранжированных клонотек специфических фрагментов кДНК TCR
из трех индивидуальных больных анкилозирующим спондилитом нами были
идентифицированы выраженные клональные экспансии ряда клонов
Т-лимфоцитов. Подобных экспансий в норме не наблюдается для здоровых
людей, что подтверждается и нашими экспериментальными данными. Более
того, мы продемонстрировали, что ряд таких клональных экспансий в крови
больных анкилозирующим спондилитом держится на стабильно высоком уровне
представленности в течение не менее 2-х лет. По мере накопления данных
по характеристике клональных экспансий Т-лимфоцитов из ряда пациентов
мы рассчитываем выявить закономерности как в типе Т-лимфоцитов, так и в
структуре представляемых ими TCR. Уже сегодня полученные данные
позволяют сделать предварительные выводы о неслучайном распределении
клональных экспансий Т-лимфоцитов в крови больных анкилозирующим
спондилитом.
Вторая часть проекта направлена на разработку эффективных и безопасных
методов селективной супрессии семейств и клонов Т-лимфоцитов с
использованием различных вариантов TCR-вакцинации. На модели линии
мышей BALB мы планируем провести сравнительное тестирование ряда
существующих подходов (таких как иммунизация пептидами,
соответствующими CDR2 и CDR3 мотивам TCR, иммунизация V доменами TCR и
ДНК-иммунизация соответствующими фрагментами), их модификаций и
некоторых принципиально новых вариантов вакцинации. По целому ряду из
указанных подходов уже ведется активная работа. В конечном итоге, целью
данного направления проекта является отработка метода иммунизации,
направленного на провокацию выраженного и специфичного иммунного ответа
и эффективное подавление выбранных семейств либо клонов Т-лимфоцитов,
при минимальных побочных эффектах и минимальном влиянии на
представленность других семейств и клонов в репертуаре периферических
Т-лимфоцитов.
|